麻疹是一种病毒性人畜共患病，在一些西非和中非国家的动物和人类中流行。该疾病过去曾多次通过受感染的动物或旅行者传入非洲大陆以外的国家，其中一次导致了2022年前所未有的全球疫情，并在人与人之间传播。尽管及时和可靠的诊断是任何疾病控制的基石，但准确诊断分析的可用性和诊断分析的比较性能研究仍然有限，尽管早在1970年就已确定猴痘病毒(MPXV)为人类病原体。我们实验室开发了一种实时PCR检测(LDT)，并对其与商业TaqMan?猴痘病毒微生物检测试验(Applied Biosystems, Cat A50137)的性能进行了评估。LDT的检出限为1.2个基因组拷贝/ml。两种方法的敏感性和特异性分别为99.14%和100%，均能检测到MPXV的I和II支。我们的结果证明了LDT从病变拭子样本中确认MPXV感染的有效性和准确性。
猴痘是一种病毒性人畜共患疾病，由猴痘病毒(MPXV)引起，历史上发生在存在动物宿主的西非和中非国家;然而，从2022年5月起，它作为持续人际传播的一部分在全球报告[1]。m痘最突出的症状是水泡性脓疱性皮疹，可导致与其他皮疹疾病混淆，包括水痘、单纯疱疹、播散性带状疱疹、梅毒、麻疹、疥疮、细菌性皮肤感染等，在临床鉴别诊断疑似m痘患者时需要考虑到这一点。在非洲国家，人们通常将mpox与水痘混淆[2]，而在2022年暴发期间，非非洲国家的mpox有时在临床上被误诊为性传播感染，如单纯疱疹或梅毒，因为患者通常表现为生殖器病变[3]。因此，需要对m痘病毒感染进行准确的实验室确认，以诊断并为m痘患者提供最佳的临床护理。确定、跟踪和管理麻疹病例接触者以防止进一步传播并制定有效的控制和预防措施也很重要。Mpox实验室确认依赖于对皮肤病变材料的核酸扩增试验(例如实时PCR)，或者在口咽、肛门或直肠拭子样本没有皮肤病变的情况下[4]。MPXV存在两个支系——主要在刚果盆地传播的I支系，历史上造成了更严重的疾病，而II支系主要在西非发现，但过去曾多次输出，也导致了当前全球多国mpox暴发[5]。
在目前主要影响南半球国家的多国暴发之前，没有可用于MPXV临床表现评估的商业实验室检测方法。MPXV的确认主要依赖于内部实验室开发的检测(LDT)，然而，在已知MPXV在动物和人类中传播的国家，即使这些检测也常常无法获得。这对监测产生了重要的负面影响，从而影响了我们对麻疹负担的理解。MPXV循环的地域扩展增加了对诊断的需求，并促进了商用试剂盒的快速发展[6,7]。
我们开发并验证了一种实时聚合酶链反应(PCR)检测方法，用于确认麻疹病毒，并在2022年比利时鲁汶市麻疹暴发的初始阶段成功地用于诊断麻疹疑似病例。在这里，我们报告了LDT设计和验证过程的细节，并说明了其分析和临床有效性。
MPXV进化支I样本:2016年在刚果民主共和国采集的5份MPXV阳性DNA样本由刚果国家生物医学研究所(Institut National de Recherche biomdicale;金沙萨(刚果民主共和国)。这些DNA样本是在mpxv感染患者皮肤病变的INRB处局部提取的。MPXV分支II型样本:在KingFisher?Flex系统(ThermoFisher)上，使用MagMax病毒病原体II型核酸分离试剂盒，从62例MPXV患者的病变拭子样本中提取病毒DNA。水痘带状疱疹病毒(VZV)样本:使用用于KingFisher?Flex系统(Thermo Fisher)的MagMax病毒病原体II核酸分离试剂盒，从16例VZV确诊患者的病变拭子样本中提取病毒DNA。单纯疱疹病毒2 (HSV-2)样本:使用用于KingFisher?Flex系统(ThermoFisher)的MagMax病毒病原体II核酸分离试剂盒，从2例确诊的HSV-2患者的病变拭子样本中提取病毒DNA。2022年5月，在比利时鲁汶UZ (Leuven)从mpox疑似患者中采集了MPXV Clade II、VZV和HSV-2样本，并在那里得到了确认。
引物和探针
从GenBank中检索来自进化枝I和进化枝II的MPXV分离物基因组(accession numbers: KJ642619.1, KJ642618.1, KJ642613.1, KP849469, KJ642617, DQ011157.1)，并使用MEGA7进行比对[8]。选取MPXV保守区开放阅读框(ORF) O2L(长度为662 bp)作为引物和探针设计模板。使用Integrated DNA Technologies PrimerQuest?工具设计引物和探针[9]。引物的熔融温度(Tm)选择在58 ~ 60℃之间，而探针的熔融温度(Tm)选择在7°~ 10°以上，以确保在聚合发生之前探针结合一致。使用在线工具Oligo Calc检查寡核苷酸的自互补性[10]。MPXV探针在5′端与6-FAM作为染料连接，在3′端与ZEN-IBFQ (ZEN-Iowa黑色荧光猝灭剂)连接，最大发射波长为518 nm(表1)。引物和探针购自比利时Integrated DNA Technologies公司。使用Blastn (Optimize for somewhat similar sequences)对每个引物和探针分别于2023年2月24日对数据库核苷酸集合(nr/nt)进行BLAST搜索。该生物被设定为猴痘病毒(taxid: 10244)。
表1 MPXV的引物和探针
定量聚合酶链反应
用TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Applied Biosystems, USA)在20μL反应混合物中进行qPCR，反应混合物中含有5μL DNA模板，5μL 4× TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix, 250-nM(终浓度;FC)探针，900-nM (FC)正向引物，900-nM (FC)反向引物，水(Sigma-Aldrich, USA)高达20μL。反应在以下条件下进行:95℃下20 s, 95℃下3 s, 60℃下30 s的45个循环(快速模式)。反应在Quantstudio?7 Flex实时PCR系统(Applied Biosystems, Thermo Fisher)上进行。
有限公司通过桑格测序确认
PCR产物使用ExoSAP-IT试剂盒(Applied Biosystems, USA)纯化，并送往Macrogen设施(荷兰)进行Sanger测序。使用SeqMan 7.0.0版软件对得到的序列进行分析和校正。使用Blastn (Optimize for somewhat similar sequences)于2023年2月15日对数据库核苷酸集合(nr/nt)进行BLAST搜索。经鉴定，该序列为猴痘病毒。
通过将MPXV DNA标准品(Integrated DNA Technologies, Belgium)稀释至10倍，浓度在1至1,000,000拷贝/μL之间，并确定与每种浓度相关的循环阈值(Ct)，生成拷贝数定量的标准曲线。这是重复进行的，并将平均Ct值与MPXV标准浓度绘制，以生成标准曲线。采用Excel version 2208 (Microsoft, Redmond, WA)确定标准曲线方程和R2值。MPXV的估计检测拷贝数由标准曲线方程外推。检测限是通过检测21个双重稀释的重复来确定的，其中MPXV拷贝数在2.4拷贝/μL和0.3拷贝/μL之间(图1)。
图1
标准曲线LDT MPXV法
为了评估LDT的敏感性和特异性，我们检测了2022年多国家猴痘暴发(II支系)期间收集的62份mpxv阳性样本(II支系)和54份mpxv阴性样本(其中16份vzv阳性，2份hsv -2阳性)，并将其与TaqMan?猴痘病毒微生物检测试验(应用生物系统公司，Cat A50137)进行比较。用TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Applied Biosystems, USA)在20μL反应混合物中进行LDT，反应混合物中含有5μL DNA模板、5μL 4× TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix、250 nm (FC)探针、900 nm (FC)正向引物、900 nm (FC)反向引物和20μL的水(Sigma-Aldrich, USA)。反应在以下条件下进行:95℃下20 s, 95℃下3 s, 60℃下30 s的45个循环(快速模式)。反应在Quantstudio?7 Flex Real-Time PCR系统上运行，使用Quantstudio Real-Time PCR Software, v1.7.2进行分析。(应用生物系统公司，赛默飞世尔)商业TaqMan?猴痘试验根据制造商的说明在Quantstudio?7 Flex实时荧光定量PCR系统(Applied Biosystems, Thermo Fisher)上进行。
2017年，我们还对DRC(进化支I)的5个MPXV DNA样本进行了LDT测试。反应在20μL的反应液中进行，反应液中含有5μL DNA模板、5μL 4× TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix、250-nM (FC)探针、900-nM (FC)正向引物、900-nM (FC)反向引物和20μL的水(Sigma-Aldrich, USA)。反应在以下条件下进行:95℃下20 s, 95℃下3 s, 60℃下30 s的45个循环(快速模式)。反应在7500 Fast Real-Time PCR系统(Applied Biosystems, USA)上运行，使用7500 Fast System Software v1.3.1进行分析。由于缺乏DNA样本，反应不能在Quantstudio?7 Flex Real-Time PCR系统上重新进行。
摘要
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材料与方法
结果
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对forward和reserve引物进行BLAST搜索，绝大多数序列的查询覆盖率和一致性达到100%(> 99.5%)。在探针(ACCGGTAATCTTGTCGATGAGGACA)中发现了与西非进化支(包括来自当前疫情的进化支)基因组的单一不匹配。
我们的LDT的分析灵敏度，即根据标准曲线(图1)的检测限为1.2 copies/μL, 95.5%的重复检测为阳性，标准差为0.972。
62个MPXV样本中有61个的LDT检测呈阳性(表2)，Ct值在Ct 13和Ct 38之间。30.7%的Ct值小于20，相当于115,000拷贝/μL以上。19.4%的样品Ct值大于30，对应于小于153拷贝/μL。LDT检测为阴性的样本在TaqMan?猴痘检测中显示弱阳性结果(Ct 38)。一份MPXV样本在TaqMan?猴痘试验中也被检测为阴性，而在LDT试验中被证实为阳性，Ct值为35.9。另外61份样本的TaqMan?猴痘检测呈阳性，Ct值在13.6至38之间。由于制造商没有披露检测的ORF目标，因此无法进行绝对定量，因此无法确定商业检测中每μL的相应拷贝数。LDT和TaqMan猴痘法的Ct值中位数差为0.7,LDT的Ct值较低。结果显示两种方法的一致性良好(98.3%)。LDT的诊断灵敏度为99.14%。TaqMan?猴痘测定法的诊断敏感性未由制造商报告，而我们确定其与我们的LDT相同，为99.14%。
表2 LDT和TaqMan?Monkeypox化验
所有mpxv阴性样本(VZV和HSV2阳性)在LDT和TaqMan?猴痘试验中均呈阴性(表2)，显示100%的特异性。
DRC的所有5个MPXV DNA样本均呈阳性，Ct范围为15.3至24.6(图2)。
图2
?Rn vs使用LDT MPXV检测的5个MPXV分支I临床样本的周期表示
2022年5月开始的多国m痘疫情在开发和制造用于诊断m痘的商业实验室检测方面发挥了重要作用;然而，它们的可用性在地理区域之间还不是均匀的。商业诊断检测非常重要，特别是在国家参考实验室的常规m痘诊断中。然而，在某些情况下，可靠的LDT可能适合使用，例如，研究目的、缺乏商业测试、引物和探针序列的透明度以及ORF靶标等。我们开发并验证了一种内部实时PCR检测方法，并将其性能与商业TaqMan?猴痘检测方法进行了比较。
LDT能够检测MPXV的两个分支。虽然我们只能研究该方法对比利时当前暴发的II支病毒的敏感性和特异性，但我们在计算机上(针对所有已知的MPXV基因组)和来自刚果民主共和国的5个临床样本证实，该方法也能够检测I支病毒。在一些MPXV基因组的开放阅读框O2L中发现的微小遗传变化并未影响我们的LDT的性能。商业MPXV检测试剂盒的制造商报告说，他们也进行了计算机分析，结果显示96%的序列同源性为100%，4%的序列在引物的5 '端不匹配。他们声称这种不匹配是微不足道的，预计不会影响性能[11]。然而，我们无法复制结果，因为制造商没有透露目标病毒的ORF。
美国疾病控制和预防中心发布了关于肿瘤坏死因子(TNF)受体基因显著缺失的警告，该基因是一些西非MPXV和通用MPXV实时PCR检测的目标。这种缺失导致了这些测试的假阴性结果[12]。我们的LDT不靶向MPXV TNF受体基因，该基因的缺失不会影响我们的LDT及其敏感性。该缺失是否会影响TaqMan?猴痘检测，目前还无法确定，因为制造商没有披露该检测针对的病毒ORF的信息。
LDT的分析灵敏度为1.2拷贝/μL，低于其他一些经测试的商业测定法和已发表的LDT[13,14]，我们能够以3拷贝/μL检测临床样品，使该测定法具有临床相关性。LDT的诊断敏感性为99.14%，特异性为100%。在116个样本中，只有两个MPXV样本在我们的LDT和商业TaqMan?猴痘测定之间显示不一致。其中一个样本的LDT检测呈弱阳性，Ct值为35.9，对应于3.07拷贝/μL, TaqMan?猴痘检测呈阴性。另一份样本在TaqMan?猴痘检测中Ct值更高，为37.9，但在LDT检测中呈阴性。这个病毒载量在我们的LDT检测极限附近。在54份mpxv阴性样本中，两种检测方法均100%为阴性。
用于MPXV LDT验证的所有样本(包括VZV和HSV-2)都是在怀疑m痘感染时作为当前m痘暴发的一部分收集的(采用相同的样本收集程序)，这一事实保证了LDT在m痘暴发背景下的敏感性和特异性的代表性。
本研究的主要局限性是由于可获得的样本数量有限，无法确定LDT对进化枝I样本的敏感性和特异性。尽管如此，在5个进化支I DNA样本中的5个样本上进行的计算机评估和病原体的成功鉴定证实，LDT可以正确识别目前在世界范围内流行的两个进化支。此外，由于缺乏临床样本，无法验证对其他正痘病毒的特异性。虽然天花已被根除，但牛痘和牛痘能够在人类中引起疾病，但并不常见。
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